用於檢測半胱氨酸的熒光探針(非常專業)

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研究背景

生物硫醇在人體內主要以低分子硫醇或蛋白質硫醇的形式存在,主要包括半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)、同型半胱氨酸(Hcy)和蛋白質中的半胱氨酸殘基。當細胞內或外部環境發生變化時可以轉化為不同的氧化中間體,在各種生理過程中發揮著重要作用,如維持氧化還原平衡、蛋白質合成和解毒。

許多研究表明,這些硫醇的內源濃度變化與相應的酶和蛋白質的功能狀態有關。它們的異常水平與疾病有關。胱硫醚b-合成酶(CBS)催化同型半胱氨酸(Hcy)與絲氨酸縮合生成胱硫氨酸(Cystathionine),絲氨酸再被胱硫氨酸葡萄糖裂解酶(CSE)水解為半胱氨酸(Cys)。

半胱氨酸是構成谷胱甘肽(GSH)的天然成分之一。它是人體的一種非必需氨基酸,主要存在於蛋白質中。半胱氨酸水平異常會導致許多疾病,如兒童生長遲緩、肝臟損傷、缺血性中風、頭髮色素沉著、水腫、嗜睡、面板損傷和虛弱、肌肉和脂肪減少等。由於生物硫醇具有相似的結構和對環境的敏感性,開發新的工具對其進行區分和動態檢測仍然是一個巨大的挑戰。

熒光成像技術以其非侵入性、高特異性、視覺化、實時動態監測等優點逐漸進入研究人員的視野。近年來,許多熒光探針被廣泛應用於生物活性物質的成像,以揭示細胞內或體內的生命現象。選擇了2,4-二硝基苯磺醯基、丙烯醯基、2,4-硝基苯並二惡唑(NBD)等一系列受體作為探針設計的識別基團,並對它們之間的差異進行了總結和比較(Fig 1A)。

儘管目前已經開發了很多用於半胱氨酸檢測的熒光探針,但現有的熒光探針都存在這樣或那樣的不足(生物相容性、選擇性和靈敏度),這極大地限制了它們在實際應用過程中的應用。而且,大多數研究都集中在新型探針的設計上,很少有研究考慮將其用於實時監測應激反應半胱氨酸的波動,以揭示其在生命系統中的作用。因此,需要開發一種新的成像策略來為應激反應半胱氨酸的波動提供視覺證據。

本文的工作

用於檢測半胱氨酸的熒光探針(非常專業)

圖 1

考慮到這些因素,作者設計併合成一種半胱氨酸選擇性熒光探針來監測半胱氨酸的波動,併為應激響應生命系統中的半胱氨酸波動。作者開發了一種用於生物硫醇感測的化學共價策略,使用的是含有甲基亞碸部分的化合物和蛋白質硫醇標記。

因此,作者利用近紅外谷胱甘肽熒光探針成功地評價了線粒體谷胱甘肽在腦缺血/再灌注損傷中的保護作用。在這項工作中,作者選擇化合物2(圖 1B)作為熒光團,因為在作者以前的工作中發現它的骨架適合於比率熒光探針設計。2,4-二硝基苯磺醯被選為識別基團是因為它的兩個特性:一是它是一個強缺電子基團,能有效猝滅熒光團的熒光;另一種是可以用較強的親核劑取代,這可能為根據生物硫醇的電離常數(PKA,Cys,8。3;GSH,8。8;Hcy,10。0)進行鑑別檢測提供了潛在的可能性。

作者成功地設計併合成了熒光探針1來檢測半胱氨酸,其靈敏度和選擇性高於谷胱甘肽和同型半胱氨酸。它可用於活體細胞內源性和外源性半胱氨酸的成像。更重要的是,作者還成功地監測了半胱氨酸的波動,並透過Hg2+和H2O2刺激證實了細胞內半胱氨酸水平與氧化應激之間的關係(圖 1B)。

用於檢測半胱氨酸的熒光探針(非常專業)

圖 2

為了評價該探針在活細胞中監測半胱氨酸(Cys)的能力,作者將其應用於Hep G2細胞內源性半胱氨酸(Cys)的成像。用探針孵育細胞,分別觀察5、15、20、30min。如圖2所示,隨著時間的推移,綠色熒光訊號逐漸出現並變強。結果表明,該探針可用於活體細胞內源性半胱氨酸的檢測。

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圖 3

用半胱氨酸(Cys)預處理30 min,將外源性Cys匯入活細胞,然後用探針進一步孵育30 min。如圖3 f和g所示,由於外源新增提高了半胱氨酸水平,綠色熒光訊號明顯變強。為了減少半胱氨酸的含量,選用巰基清除劑N-乙基馬來醯亞胺(NEM)對半胱氨酸進行封閉。Hep G2細胞與NEM孵育30 min,再與探針孵育30 min。共聚焦成像結果顯示,NEM治療後綠色熒光明顯減弱,幾乎消失(圖 3h)。熒光可以透過隨後外源新增半胱氨酸來恢復(圖 3i)。這些結果有力地證實了該探針是監測Cys波動的實用工具。

在生命系統中,半胱氨酸以獨立的個體或蛋白質半胱氨酸(包括RSH和RSSR)的形式存在。在氧化條件下,RSH可以被氧化並轉化為二硫化物。為了瞭解蛋白質半胱氨酸的變化,作者用NEM封閉硫醇,然後用三(2-羧乙基)膦(TCEP,一種生物體系中常用的二硫鍵裂解還原劑,1 mM)處理30 min。細胞與探針孵育後,在通道中觀察到綠色熒光(圖 3j)。在這一部分,作者成功地利用NEM和TCEP進行了調節半胱氨酸水平的成像實驗,以評估探針在監測半胱氨酸波動方面的實際應用。

用於檢測半胱氨酸的熒光探針(非常專業)

圖 4

重金屬離子,如Hg2+和Cd2+。,因其對環境安全和公眾健康的危害而引起人們的廣泛關注。這些金屬離子很容易透過食物鏈積聚在體內,最終導致多項嚴重疾病。然而,很少有研究提供重金屬離子如何影響內源性生物分子波動的可視證據。考慮到Hg2+對硫的高度親和力,作者探討了Hg2+與半胱氨酸水平的關係。

如圖4A所示,低濃度的Hg2+沒有引起明顯的熒光變化(小於20 mM)。當Hg2+濃度達到50 mM時,熒光被顯著猝滅,表明半胱氨酸水平受Hg2+的調節。結果表明,Hg2+與半胱氨酸(包括蛋白半胱氨酸殘基)的配位直接降低了半胱氨酸的濃度;二是Hg2+配位引起的氧化應激爆發降低了系統的抗氧化能力,從而進一步降低了半胱氨酸的濃度。

為了闡明Hg2+對半胱氨酸水平的調控,作者進行了不同濃度的H2O2預處理半胱氨酸的成像實驗。如圖4B所示,當細胞與100 mM H2O2孵育時,熒光略有增強。在生物抗氧化系統的調節能力範圍內,細胞會促進半胱氨酸的生物合成以對抗氧化應激。當H2O2濃度增加(大於300 mM)並超過自我調節時,半胱氨酸將被消耗,導致熒光衰減。這些結果表明,該探針可用於監測Hg2+誘導的活細胞半胱氨酸波動,首次為Hg2+調控半胱氨酸波動提供了直觀證據,為揭示重金屬離子中毒的機制開闢了一條新的途徑。

文獻原文:

Yang, Y。; Zhang, L。; Zhang, X。; Liu, S。; Wang, Y。; Zhang, L。; Ma, Z。; You, H。; Chen, L。, A cysteine-selective fluorescent probe for monitoring stress response cysteine fluctuations。 Chem Commun (Camb) 2021。

DOI:

10。1039/D1CC01110C

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