當接種環在珠存菌種表面上劃過時,將附著足量的細胞

下面的Hanahan方案結合了Hanahan 等(1991) 描述的方法和多年來公開的各種專利(美國專利6709852、6855494 和6960464)。CCMB80轉化緩衝液(美國專利6960464)用來代替最初Hanahan (1983) 所述的TSB和FSB緩衝液。

用接種環直接將凍存的大腸桿菌菌種在SOB瓊脂平板表面劃線,在23C下孵育平板16h。沒有必要融化凍存的細菌。當接種環在珠存菌種表面上劃過時,將附著足量的細胞。一管凍存菌種可以使用很多次。如果培養箱不能設定到23C,可以在室溫下孵育SoB平板。

當接種環在珠存菌種表面上劃過時,將附著足量的細胞

2。將4或5個分開的菌落轉移到含2mL SOB的17mmX 100mm聚丙烯管中。菌落直徑應該不超過2~ 3mm。可根據需要設定多個2mL培養物。

3。在振盪培養器中23‘C培養16h。

4。在每份培養物中,新增無菌甘油至終濃度為15% (V/V)。

5。分裝到2。5mL凍存管中,每管1mL。將凍存管裝入到一個塑膠密封袋中,浸入乾冰/乙醇浴中5min。

當接種環在珠存菌種表面上劃過時,將附著足量的細胞

6。將塑膠袋及其內容物轉移到- 80”C冰箱。感受態細胞的製備

7。將1mL小管裡的原種細胞接種到250mL SOB培養基(來自上述步驟6)。

8。在振盪培養器中20C孵育約16h。 不時地從培養物取-份樣品,測定其在600nm的光密度。不要讓培養物的0D000大於0。26。

9。將培養物轉移到預冷的平底離心瓶中,4’C 離心10min。

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